Mécanismes moléculaires des effets antihyperglycémiques de l’extrait de Costus speciosus chez les rats diabétiques induits par la streptozotocine

Résumé

Objectifs :

Étudier les mécanismes de l’effet antihyperglycémique des extraits éthanoliques de racine de Costus speciosus (C. speciosus) (CSREt) en évaluant son action sur la synthèse de l’insuline et l’expression génique de l’enzyme catabolique du glucose et ses activités chez les rats diabétiques streptozotocines (STZ).

Méthodes :

Cette étude a été réalisée au Laboratoire de biochimie de la Faculté de médecine vétérinaire de l’Université de Zagazig, Zagazig, Egypte entre juillet et août 2013. Soixante rats albinos mâles (120 ± 20 g de poids et 6 mois) ont été utilisés et répartis en 6 groupes (n=10). Deux groupes ont servi de témoins diabétiques et non diabétiques. Quatre groupes d’animaux diabétiques STZ ont reçu C. speciosus (CSREt) par voie orale à des doses de 200, 400 et 600 mg/kg de poids corporel et de 600 µg/kg de glibenclamide, un médicament standard, pendant 4 semaines.

Résultats :

Le CSREt 400 et 600 mg/kg de poids corporel a induit une diminution de la glycémie et une augmentation du taux d’insuline sérique, de la glucokinase (GK), de l’aldolase, de la pyruvate kinase (PK), de la succinate déshydrogénase (SDH), et des activités glycogène synthase, en plus de la hausse du taux d’expression des protéines insuline, récepteur A (IRA), GK, PK, SDH et transport du glucose.

Conclusion

Le C. speciosus a une activité antihyperglycémique. Il induit la sécrétion et la libération d’insuline par les cellules, et stimule la sensibilité des tissus à l’insuline, ce qui entraîne une augmentation de l’absorption, du stockage et de l’oxydation du glucose dans les tissus.


Le diabète sucré peut être défini comme un état d’hyperglycémie chronique causé par une insuffisance relative ou absolue du taux d’insuline dans le sang.1 Un grand nombre de personnes dans le monde souffrent de diabète ; l’augmentation alarmante de son incidence en fait un problème de santé grave.2 L’hyperglycémie persistante chez les patients diabétiques est l’inducteur de complications du diabète de type 2, comme la coronaropathie, l’hyperlipidémie, la maladie cérébrovasculaire, la cécité, l’insuffisance rénale, les complications neurologiques, l’amputation des membres et le décès prématuré.3 Les médicaments antidiabétiques actuellement disponibles peuvent avoir certaines limites et certains effets secondaires ; par conséquent, la tendance croissante au traitement du diabète de type 2 a été orientée vers l’utilisation d’agents naturels, comme les herbes médicinales.4 Les plantes médicinales ont toujours fait partie de la culture humaine et jusqu’à 80 % de la population mondiale dépend de ce système pour certains aspects des soins primaires de santé. Un grand nombre de plantes folkloriques sont encore utilisées comme phytothérapies au Royaume d’Arabie saoudite, dont Costus speciosus (C. speciosus[Koenig]).5 Le C. speciosus a une distribution très large en Inde en tant que contrôleur diabétique, habituellement les patients diabétiques mangent une feuille par jour pour maintenir leur glycémie basse.6 L’extrait d’hexane du rhizome possède une activité antihyperglycémique et hypo-lipidémique7, inverse le diabète et ses complications8, améliore l’activité des enzymes antioxydantes hépatiques, affecte les neurotransmetteurs et l’activité de la monoamine oxydase9, les propriétés anti-inflammatoires et antipyrétiques10 et une importante activité hépatoprotectrice contre le tétrachlorure de carbone induisant une hépatotoxicité.11 Le C. speciosus a une énorme teneur en glycosides de spirostanol et en furostanol glycoside 26-O-bêta-glucosidase (F26G), qui a des effets hypoglycémiques.5 Le mécanisme de l’action antihyperglycémique de C. speciosus n’a pas été clairement étudié ; l’objectif de ces travaux était donc d’étudier, au niveau moléculaire, les mécanismes possibles de l’action antihyperglycémique de C. speciosus en surveillant ses effets sur l’expression génétique et les activités des enzymes glycolytiques dans la streptozotocine (STZ)-diabétiques mâles.

Méthodes

Cette étude a été réalisée au Laboratoire de biochimie de la Faculté de médecine vétérinaire de l’Université de Zagazig, Zagazig, Egypte entre juillet et août 2013. Les racines de C. speciosus (3 kg) ont été obtenues auprès de la société pharmaceutique de Ragb, Le Caire, Egypte, et authentifiées par le Département des sciences végétales, Université du Canal de Suez, Ismailia, Egypte. L’extrait éthanolique des racines de C. speciosus a été préparé dans de l’éthanol à 95 %.8 Les extractions ont continué jusqu’à ce que le solvant dans le dé à coudre devienne clair. Après extraction, l’extrait a été filtré et le solvant a été évaporé à température ambiante. Le résidu séché a été maintenu à 4°C.

Des rats mâles albinos Sprague-Dawley Sprague-Dawley (n=60) pesant environ 120±20 et âgés de 6 mois ont été utilisés dans cette étude. Les rats étaient logés dans des cages en polypropylène. Ils ont eu accès à des granulés de laboratoire standard et à de l’eau ad libitum. Les animaux ont été hébergés dans un cycle lumière/obscurité à une température ambiante de 24±3°C. Des aiguilles d’alimentation (calibre 18) ont été utilisées pour l’administration orale. Les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux lignes directrices égyptiennes en matière de soins aux animaux de laboratoire. Le Collage de médecine vétérinaire du Comité d’éthique de l’Université Zagazig a approuvé l’expérience en cours. Tous les animaux de laboratoire après acclimatation pendant 2 semaines avant le traitement ont été divisés en 6 groupes (n=10). Le premier groupe sert de témoin normal et a reçu 5 % de Tween-80 (un ml/kg de poids corporel[p.c.]), et les rats des 5 autres groupes ont reçu une injection intrapéritonéale (i.p.) de STZ (65 mg/kg p.c.) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) pour induction du diabète. Le deuxième groupe a été laissé comme contrôle diabétique. D’autres groupes ont reçu des doses différentes, comme 200 mg/kg p.c. d’extraits éthanoliques de racine de C. speciosus (CSREt) dans le groupe 3, 400 mg/kg dans le groupe 4, 600 mg/kg dans le groupe 5, et le groupe 6 a reçu 600 µg/kg p.c. de glibenclamide.

Le CSREt et le glibenclamide ont été mis en suspension quotidiennement dans un mL de Tween-80 à 2 % et administrés aux animaux pendant 4 semaines. Le DM a été induit par une seule injection i.p. de STZ (65 mg/kg p.c.) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA). La STZ a été fraîchement préparée dans un tampon de citrate de sodium froid de 0,01 M (pH : 4,5) immédiatement avant utilisation.12 Les rats traités avec la STZ ont reçu 5 % poids/volume de glucose pendant les 24 heures suivantes pour prévenir l’hypoglycémie. Après 72 heures, des rats ayant une glycémie à jeun supérieure à 200 mg/dl ont été sélectionnés comme rats diabétiques. Après 4 semaines de traitement, tous les rats ont été privés de nourriture pendant la nuit, puis sacrifiés sous anesthésie, et des échantillons de sang, de foie et de pancréas ont été recueillis. Des échantillons de sang ont été prélevés dans le canthus médian de l’œil et les sérums (environ 800 µL) ont été séparés par centrifugation et conservés à -20°C pour une étude biochimique. Des échantillons de foie ont été prélevés et préparés en vue d’études biochimiques plus poussées. D’autres parties du foie et des tissus pancréatiques ont également été congelées dans l’azote liquide utilisé pour l’analyse moléculaire. Les taux de glycémie (mg/dl) ont été déterminés par la méthode de la glucose-oxydase à l’aide d’une trousse obtenue de SPINREACT, Girona, Espagne. Les taux d’insuline sérique ont été déterminés à l’aide d’une trousse de dosage immuno-enzymatique spécifique à l’insuline de rat (n° de catalogue ezrmi-13kelisa, Billerica, MA, USA). Un gramme de chaque échantillon de tissu hépatique a été homogénéisé dans 9 mL du tampon d’homogénéisation à un pH de 7,4 pour la préparation de l’homogénat de tissu.13 Cet homogénat a été utilisé pour doser les activités des enzymes hépatiques. L’activité de la glucokinase hépatique (GK) a été déterminée en mesurant le glucose-6-phosphate (G6P) formé par la GK par formation de nicotinamide-adénine dinucléotide phosphate en présence de l’enzyme glucose-6-phosphate déshydrogénase.13 L’activité du succinate déshydrogénase (SDH) a été mesurée en contrôlant la réduction du 2, 6-dichlorophénolindophénol à 600 nm.14 L’activité de l’aldolase hépatique a été dosée par spectrophotométrie à 340 nm à l’aide de la trousse Colorimetric Assay (Biovision, no K665-100 au catalogue, Milpitas, CA, USA), où une unité d’activité aldolase est définie comme la quantité d’enzyme qui produit un µmol de NADH par minute à 25°C.15 L’activité pyruvate kinase (PK) hépatique a été déterminée dans l’homogénat hépatique avec 50 mM de glycylglycine, 15 mM d’acide éthylène diamine-tétraacétique (EDTA) et 5 mM de phosphate de potassium. L’activité pharmacocinétique totale a été déterminée dans les surnageants tel que décrit.16 L’activité de la glycogène synthase (GS) a été mesurée dans des homogénats en présence de 6,6 mM de G6P, et l’activité enzymatique a été exprimée en mU/mg de protéine.17 La teneur en glycogène hépatique a été déterminée comme décrit précédemment.18 La concentration en protéines de l’homogénat hépatique a été mesurée à l’aide d’un réactif de dosage Bio-Rad.17 L’ARN total a été extrait du foie et des tissus pancréatiques à l’aide du mini kit RNeasy (réf. 74104, Qiagen, Chine) selon les instructions du fabricant. La quantité d’ARN extrait a été quantifiée et qualifiée à l’aide du spectrophotomètre NanoDrop® ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware, USA). La pureté de l’ARN a été vérifiée et a varié entre 1,8 et 2,1, ce qui démontre la haute qualité de l’ARN. Le premier brin d’ADNc a été produit en utilisant un kit spécifique fourni par Fermentas (Pittsburgh, PA, USA). L’amplification en chaîne par polymérase (PCR) a été réalisée par (2×) PCR Master Mix (Fermentas Inc., Pittsburgh, PA, USA). Un thermocycleur 2720 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a été utilisé pour effectuer les réactions PCR. Nous avons utilisé 10 pmol/µL de chaque amorce avant et arrière pour les gènes mesurés. Le gène d’entretien ménager β-actin a été utilisé comme contrôle constitutif pour la normalisation. Tous les apprêts ont été fournis par Sigma Aldrich (Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne) comme indiqué dans le tableau 1. Les produits PCR amplifiés ont été analysés sur un gel d’agarose à 1,5 % teinté de bromure d’éthidium dans 1x tampon EDTA d’acétate de tris (TAE) (pH : 8,3-8,5) (Figure 1). L’image électrophorétique a été visualisée et analysée par un système de documentation sur gel (Bio Doc Analyze, Biometra, Göttingen, Allemagne).

L’analyse statistique des données a été effectuée dans Predictive Analytics SoftWare Statistics for Windows version 18 (IBM SPSS Statistics, Endicott, New York, USA). L’analyse unidirectionnelle de la variance a été utilisée pour déterminer les différences statistiques entre les groupes, suivie du test à plages multiples de Duncan pour analyser l’homogénéité intergroupe. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart-type. P<0,05 a été jugé statistiquement significatif.

Résultats

Le groupe diabétique induit par la STZ présentait une glycémie élevée et de faibles taux d’insuline sérique, des activités hépatiques GK, SDH, aldolase, PK et GS, et une teneur en glycogène hépatique supérieure à celle des rats témoins. Chez les animaux ayant reçu CSREt, on a observé une diminution de la glycémie et une augmentation de l’activité des récepteurs hépatiques GK, SDH, aldolase, PK et GS, ainsi qu’une augmentation des taux sériques d’insuline et de glycogène hépatique comparativement aux rats diabétiques. L’action du CSREt dépendait de la dose, les effets les plus élevés ayant été observés chez les rats traités avec une dose de 600 mg/kg p.c. et les effets moindres avec une faible dose de 200 mg/kg p.c. comparativement au glibenclamide, un médicament standard (tableau 2). Les rats diabétiques induits par la STZ présentaient une diminution significative des taux d’insuline pancréatique, du récepteur hépatique de l’insuline A (IRA), GK, SDH, PK et du transporteur de glucose 2 (GLUT2) de l’expression génétique relative comparativement aux rats témoins. Chez les animaux ayant reçu CSREt, on a observé une augmentation des taux d’insuline pancréatique, de l’expression relative des gènes IRA, GK, SDH, PK et GLUT2 dans le foie, comparativement aux rats diabétiques. L’action du CSREt dépendait de la dose, les effets les plus élevés ayant été observés chez les rats traités avec une dose de 600 mg/kg p.c. et les effets moindres avec la faible dose de 200 mg/kg p.c. comparativement au glibenclamide, un médicament standard.

Discussion

Dans la présente étude, nous avons examiné le mécanisme de l’effet antihyperglycémique de l’extrait éthanolique de racine de C. speciosus sur des rats diabétiques induits par STZ. Notre hypothèse est que C. speciosus induit la production d’insuline et la sensibilité des tissus à l’insuline, entraînant une augmentation de l’absorption, du stockage et de l’oxydation du glucose dans les tissus. Dans cette étude, nous avons démontré l’action antihyperglycémique de CSREt chez des rats diabétiques induits par STZ. Il a diminué la glycémie chez les rats mâles diabétiques induits par la STZ, en particulier à la dose élevée (600 mg/kg p.c.), ainsi qu’avec le glibenclamide, un médicament standard. L’effet antihyperglycémique du CSREt était fonction de la dose. Bavarva et Narasimhacharya8 ont enregistré pour la première fois l’action antihyperglycémique de CSREt chez des rats diabétiques induits par alloxan. Les extraits bruts de C. speciosus ont diminué les taux de glucose sérique chez les rats diabétiques.24 L’effet antihyperglycémique de CSREt pourrait être exercé en augmentant la synthèse d’insuline et la libération par les cellules bêta de l’île de Langerhans et en induisant la sensibilité des récepteurs cellulaires à l’insuline. Ceci se manifeste par l’induction de l’expression du gène de l’insuline dans les cellules pancréatiques et de l’IRA dans les cellules hépatiques, et par l’augmentation des taux sériques d’insuline, ce qui a pour conséquence une augmentation de l’absorption du glucose par le biais de l’expression du gène GLUT2. L’effet hypoglycémiant de l’érémanthine (substance active de C. speciosus) s’est manifesté par une potentialisation de la synthèse et de la libération de l’insuline à partir des cellules bêta existantes, ainsi que par une augmentation de la sensibilité des tissus de l’insuline au glucose.25 La STZ induit une destruction sélective des lymphocytes B du pancréas, ce qui entraîne une mauvaise utilisation du glucose, induisant une hyperglycémie, mais laisse de nombreuses cellules bêta survivantes, qui peuvent être régénérées.24 Cette régénération est renforcée par l’administration de CSREt, et entraîne une stimulation de la libération d’insuline en augmentant le taux d’expression génétique, ce qui permet d’augmenter son niveau dans le sang, et d’améliorer le métabolisme du glucose. Les récepteurs de l’insuline s’expriment avec des plages différentes dans tous les tissus sensibles à l’insuline.26 Ceci renforce nos résultats, qui ont montré des niveaux élevés d’expression des gènes IRA hépatiques dans les groupes qui ont reçu des doses élevées de CSREt.

L’utilisation du glucose hépatique a été induite, peut-être en raison de l’induction de l’expression génique du gène GLUT2. Ce dernier est un transporteur de glucose lié à la membrane, présent principalement dans le foie, et non dépendant de l’insuline. Sa constante de Michaelis (Km) est élevée et le transport du glucose dans le tissu hépatique est donc illimité.19 Le glucose qui est transporté au foie est soit oxydé, soit stocké sous forme de glycogène. Le CSREt a amélioré l’activité et l’expression génique des enzymes cataboliques du glucose hépatique GK, aldolase, PK et SDH en harmonie en augmentant le niveau d’expression génique du gène de l’insuline et les taux d’insuline sérique. L’activité GK et l’expression des gènes ont augmenté chez les rats traités par CSREt comparativement aux rats diabétiques non traités. L’expression génique de la GK est corrélée à l’activité enzymatique. L’enzyme GK catalyse la première réaction de glycolyse hépatique, elle a une faible affinité glycémique avec un Km élevé. Il est donc très sensible aux variations de la glycémie.19 L’activité et les niveaux d’expression de la glycémie générale sont diminués chez les patients diabétiques.27 La glycémie générale est un marqueur thérapeutique puissant du diabète parce qu’elle améliore l’absorption hépatique du glucose et la sécrétion d’insuline du tissu pancréatique.28 L’aldolase est une enzyme bi-fonctionnelle dans la glycolyse et la gluconéogenèse ; elle est étroitement liée à la PFK-1 (phospho-fructokinase-1) dans son action puisqu’elle transforme son produit (F1, 6 bisphosphate) en glycéraldhyde-3-phosphate et dihydroxy acétone phosphate. Son niveau a été rapporté plus bas dans les modèles diabétiques29, l’augmentation de son activité après le traitement CSREt peut faire référence à une amélioration de l’oxydation du glucose. La pharmacocinétique est une enzyme glycolytique qui joue un rôle central dans le métabolisme hépatique du glucose et des lipides. Elle est régulée par phosphorylation, modification allostérique, hormones et nutriments. L’utilisation excessive du glucose par les tissus induit la glycolyse, l’activité de la L-Pyruvate kinase (L-PK), la glycogénèse, la synthèse de novo des acides gras et le stockage des lipides. La transcription du gène L-PK est induite par le métabolisme du glucose stimulé par l’insuline.21 Le traitement par 400 mg/kg p.c. de CSREt entraîne une augmentation de 40,9 % et de 54,5 % des taux sériques d’insuline et de 600 mg/kg p.c., respectivement. L’élévation de l’insuline sérique pourrait entraîner l’activation de l’expression du gène L-PK et l’activité enzymatique présentée dans nos résultats, qui font référence à l’augmentation de la voie glycolytique par un traitement avec 400 et 600 mg/kg p.c. de CSREt, alors que le traitement avec 200 mg/kg p.c. ne produit pas cet effet. Le SDH est une enzyme mitochondriale oxydante qui contrôle la transcription des gènes liés au métabolisme dans les mitochondries et favorise le métabolisme du glucose et des lipides. Les niveaux d’expression de l’ARNm SDH ont été réduits chez les animaux diabétiques.

Notre étude a montré qu’un traitement par 400 et 600 mg/kg p.c. de CSREt peut augmenter les niveaux d’ARNm de l’HNS et l’activité qui améliore le statut oxydatif chez les rats diabétiques.10 La glycogénèse est une autre voie d’utilisation du glucose dans le foie qui est directement affectée par l’insuline ; la diminution du taux d’insuline chez les rats diabétiques entraîne une diminution de l’activité des GS et donc une diminution de la teneur en glycogène hépatique31. Cette diminution de l’activité a été inversée par le traitement CSREt avec des doses de 400 et 600 mg/kg pc par la correction du taux d’insuline dans le sang. L’action hypoglycémiante de CSREt s’est accompagnée de l’activation de la GS et augmente la teneur en glycogène hépatique32.

La STZ induit une destruction sélective des cellules β pancréatiques, qui peuvent être régénérées et donner de faux résultats. D’autres études futures sont nécessaires sur les gènes génétiquement modifiés ou éliminés pour le diabète chez le rat. L’effet antihyperglycémique de C. speciosus doit être examiné chez les humains diabétiques.

Source : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4362175/

Auteur de la recherche : Haytham A. Ali, MSc, PhD, Omar A. Almaghrabi, MSc, PhD, and Mohamed E. Afifi, MSc, PhD

Du Département de biochimie (Ali, Afifi), Faculté de médecine vétérinaire, Université de Zagazig, Zagazig, Égypte, et du Département des sciences biologiques (Almaghrabi, Afifi), Faculté des sciences, Université King Abdulaziz, campus Nord, Jeddah, Royaume d’Arabie saoudite.

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